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新型内耳毛细胞时空特异性基因敲除工具Gfi1

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放大字体  缩小字体    发布日期:2020-01-13  来源:曝光台  作者:baoguangtai  浏览次数:933
唐琦   摘要:研究目的:时空特异性基因敲除是研究小鼠内耳基因功能的重要手段,它可以避免传统基因敲除导致的严重发育畸形和出生后死亡。但现有的内耳毛细胞基因敲除工具多为不可诱导的Cre重组酶,无法对成年小鼠内耳毛细胞基因进行高效的时间特异性敲除。多宝彩票_[官网首页]为了更好地实现对成年小鼠内耳毛细胞中基因功能的研究,我们设计构建了新型内耳毛细胞时空特异性基因敲除工具Gfi1-P2A-GFP-CreERT2小鼠,并对其GCE重组酶的功能进行了鉴定。研究方法:Gfi1-P2A-GFP-CreERT2小鼠的构建主要采用了胚胎干细胞显微注射的方法,将成功转染的带有Gfi1-P2A-GFP-CreERT2目的基因片段的胚胎干细胞显微注射进E3.5天的小鼠囊胚中,通过胚胎移植的方法移植到代孕母鼠子宫,最后获得Gfi1GEC/Neo嵌合体小鼠。经过多次交配后可得到稳定遗传的Gfi1GCE/+小鼠。通过长距离PCR、免疫荧光染色、耳蜗wholemount染色及听觉脑干反应检测等方法,对Gfi1GCE/+小鼠进行了鉴定。通过对Gfi1GC/+小鼠与Rosa26tdTomato reporter小鼠交配得到的Gfi1GGCE/+;Rosa26tdTmato小鼠进行研究,鉴定了 GCE重组酶的功能并找到了实现Gfi1GC/+GCE重组酶最佳酶切效率的Tamoxifen诱导方案。研究结果:基因型鉴定LR-PCR得到的1.7kb的5'端DNA序列和1.1kb的3'端序列以及使用AcGFP引物鉴定得到的508bp的DNA序列均可证明P2A-GFP-CreERT2 DNA序列被成功插入到小鼠Gfi1第6外显子之后,确定Gfi1-P2A-GFP-CreERT2小鼠构建成功。多宝彩票_[官网首页]Gfi1GCE/+小鼠中GFI1与GFP共表达,且Gfi1基因的表达和功能不受基因重组的影响,即Gfi1GCE/GCE纯合小鼠无听力下降、平衡失调等内耳发育缺陷。在GCE重组酶诱导方案方面,研究明确了对小鼠连续5天腹腔注射Tamoxifen 1mg/次,可实现耳蜗内外毛细胞内基因接近100%的敲除。研究结论:Gfi1-P2A-GFP-CreERT2小鼠构建成功,可以实现可诱导的内耳毛细胞内基因的高效、时空特异性敲除。 学位授予单位:北京协和医学院
学位级别:博士
学位授予年份:2019
分类号:Q78;R764

曲雁;马颖钰;张璞;;蛋氨酸对抗和保护化疗药物引起的内耳毛细胞损伤和死亡作用的研究[A];2010全国耳鼻咽喉头颈外科中青年学术会议论文汇编[C];2010年
曲雁;薛婵;马瑞颖;;蛋氨酸对抗和保护顺铂引起的内耳毛细胞损伤和死亡作用的研究[A];2010全国耳鼻咽喉头颈外科中青年学术会议论文汇编[C];2010年
杨永明;江红群;;体外诱导骨髓间充质干细胞向内耳毛细胞分化的实验研究[A];2010全国耳鼻咽喉头颈外科中青年学术会议论文汇编[C];2010年
苏振伦;孙燕荣;王莉;姜泗长;;钙离子载体ionomycin引起内耳毛细胞胞内游离钙变化的过程[A];中国细胞生物学学会第七次会议论文摘要汇编[C];1999年
孟飞龙;李福山;管敏鑫;赵小立;;人类ES及iPS体外诱导成内耳毛细胞的研究[A];华东六省一市生物化学与分子生物学学会2014年学术交流大会暨浙江省第十一届学会会员代表大会会议论文集[C];2014年
尹海燕;孔佑华;张慧;;NLRX1激活ROS-自噬途径加剧顺铂致感音神经性聋内耳毛细胞损伤[A];中国解剖学会2019年年会论文文摘汇编[C];2019年
赵玉珍;郝存书;张彦;;豚鼠内耳毛细胞与神经终末突触结构的超微特点[A];解剖学杂志——中国解剖学会2002年年会文摘汇编[C];2002年
乔佳彬;乔占林;宋晓平;李娟娟;;中西结合治疗感音神经性耳聋48例研究分析[A];全国疑难性心脑血管病诊疗新进展研讨会及讲习班(第七届全国疑难病学术研讨会)资料汇编[C];2009年
郑贵亮;周义德;胡博华;;膜稳定剂P-188对噪声诱发毛细胞损伤的保护作用[A];全国耳鼻咽喉头颈外科中青年学术会议论文汇编[C];2012年
赵玉珍;张连巍;张彦;;豚鼠内耳毛细胞与神经终末突触结构的超微特点(摘要)[A];中国动物学会全国显微与亚显微形态科学(细胞及分子显微技术科学)分会第十一次学术研讨会论文摘要集[C];2002年
 
 
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